---

菌种纯化培养的核心方法有哪些？如何选择适用场景？

菌种纯化培养的核心目标是??从混合微生物群体中分离单一目标菌种，并通过反复操作获得无杂菌污染的纯培养物??。实验室常用以下三种方法：

??1. 平板划线法??
??操作步骤??：

• 用灭菌接种环蘸取菌液，在固体培养基表面分区划线（如四区法）
• 每划完一区后，灼烧接种环冷却再继续下一区
• 培养后，最后一区可形成单菌落

??优势??：

• ??操作简单??，无需精确稀释
• ??适用于菌液浓度较高的样本??（如土壤、发酵液）

??注意事项??：

• 划线时需控制力度，避免划破培养基
• 火焰灼烧后需冷却至常温再接触菌液

---

??2. 稀释涂布法??
??操作步骤??：

• 将菌液梯度稀释至10??~10??浓度
• 取100μL稀释液均匀涂布于培养基表面
• 培养后挑选单菌落

??适用场景??：

• ??高密度微生物样本??（如水体、空气）
• ??需定量计数的实验??（如活菌数测定）

??关键技巧??：

• ??梯度稀释时需更换吸头??，避免交叉污染
• 涂布器需酒精灼烧灭菌后使用

---

??3. 选择培养基法??
??操作原理??：

• 利用目标菌的??特殊代谢需求??（如碳源、抗生素抗性）抑制杂菌

??应用案例??：

• 用含石油的培养基筛选石油降解菌
• 添加氨苄青霉素抑制革兰氏阳性菌

??优势??：

• ??针对性极强??，可大幅提升分离效率
• 特别适合??稀有菌种或特殊功能菌的筛选??

---

如何提升纯化效率？三大操作技巧必须掌握

??技巧一：无菌操作规范??

• ??超净工作台预运行??15分钟，紫外线灭菌30分钟
• 工具灭菌：接种环??火焰灼烧至红热??，移液枪头??121℃高压灭菌20分钟??
• 操作时保持酒精灯附近??10cm无菌区??，动作迅速

??技巧二：培养基优化??

菌种类型	推荐培养基	温度条件
细菌	LB琼脂	37℃
真菌	PDA培养基	28℃
厌氧菌	硫乙醇酸盐	厌氧罐

??特殊需求??：

• 乳酸菌需调节pH至5.5-6.0
• 纤维素分解菌可添加羧甲基纤维素

??技巧三：污染防控??

• 培养基凝固后??倒置培养??，防止冷凝水滴落
• 出现污染时??立即灭菌工具??，更换培养基批次
• 定期检测无菌水与培养基的灭菌效果

---

实验室常见问题与解决方案

??问题1：划线后无单菌落？??

• ??原因??：稀释度不足或接种环带菌量过多
• ??解决??：增加稀释梯度，改用三区划线法

??问题2：菌落形态混杂？??

• ??原因??：纯化不彻底或操作污染
• ??解决??：??重复划线3次以上??，使用选择性培养基

??问题3：菌种保存后失活？??

• ??短期保存??：斜面培养基4℃存放（1-3个月）
• ??长期保存??：甘油管法（菌液+50%甘油，-80℃冷冻）

---

个人观点

菌种纯化培养的成功率，本质上取决于??细节的把控??。我曾遇到一例土壤样本中放线菌分离失败的案例，最终发现是培养基灭菌时间过长导致营养成分破坏。这提醒我们：??既要遵循标准流程，也要根据样本特性灵活调整参数??。例如，对于生长缓慢的菌种，可将培养时间延长至7天；对于严格厌氧菌，需在接种后10秒内完成石蜡密封。唯有将规范性与创造性结合，才能突破技术瓶颈。